来源:《生物医学工程与临床》2006年第03期  作者:陈耀凯;李俊刚;王宇明;
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可回复性肝细胞永生化载体pCTGTKlox的构建、鉴定、转染与表达

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目的构建可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础。方法扩增加强型绿色荧光蛋白(EGFP)及胸腺激酶(TK)并采用重叠延伸拼接法(SOE)连接EGFP和TK,将EGFP-TK融合基因亚克隆至pBABE-puro-lox,构建成新载体pBGTKlox,再将永生化基因SV40T连接至pBGTKlox,构成新载体pBTGTKlox,最后将雌激素受体与重组酶融合基因(Cre-ER)连接至pBTGTKlox,构成新载体pCTGTKlox。将pCTGTKlox和pPDF15质粒共转染包装细胞PT67,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。免疫组化染色检测SV40T基因的表达。结果成功构建包含EGFP-TK、SV40T、Cre-ER及重组序列loxP的新载体pCTGTKlox,经酶切鉴定证实为重组阳性体,经测序验证无核苷酸突变。pCTGTKlox转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光。免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色。结论成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pCTGTKlox,为细胞的可回复性永生化提供了一种良好的新型载体。(本文共计5页)......[继续阅读本文]

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